Tekuté biopsie používají krevní nádorovou tkáň - k diagnostice rakoviny
Typicky se nádory vyšetřují pomocí biopsií tkáně. Malý vzorek je odebrán z nádoru a genotypován nebo analyzován na genetický make-up. Problémem s tímto přístupem je, že biopsie nádory mohou být náročné. Dále nádorová biopsie poskytuje pouze snímek tumoru.
Psaní v Discovery Medicine v roce 2015 uvádí Labgaa a spoluautoři o konvenční nádorové biopsii:
Ze zřejmých důvodů je obtížné monitorovat vývoj nádorů sekvenčními biopsiemi. Také biopsie odráží pouze jediné místo tumoru a je tedy nepravděpodobné, že by představovalo celé spektrum somatických mutací u velkých nádorů. Alternativou by bylo získání více biopsií pro stejný nádor, ale tato možnost se nezdá být realistická ani přesná.
Kapalinová biopsie zahrnuje měření cirkulující DNA (ctDNA) a dalších vedlejších nádorů v krevních vzorcích získaných od pacientů s rakovinou. Tento vznikající diagnostický přístup slibuje, že bude rychlý, neinvazivní a nákladově efektivní.
Historie tekuté biopsie
V roce 1948, Mandel a Métais, pár francouzských vědců poprvé identifikoval ctDNA v krvi zdravých lidí. Tento objev byl před časem, a až o desetiletí později se ctDNA dále prozkoumala.
V roce 1977 Leon a jeho kolegové poprvé identifikovali zvýšená množství ctDNA v krvi pacientů s rakovinou.
V roce 1989 Stroun a kolegové identifikovali neoplastické (tj. Rakovinové) vlastnosti v krvi. Po těchto objevech identifikovalo několik dalších skupin specifické mutace v tumorových supresorech a onkogenech, mikrosatelitovou nestabilitu a methylaci DNA, které dokázaly, že ctDNA se uvolňuje do oběhu nádorů.
I když víme, že ctDNA pocházející z nádorových buněk cirkuluje v krvi, původ, rychlost uvolňování a mechanismus uvolňování této DNA jsou nejasné, přičemž výzkum vede k protichůdným výsledkům. Některé výzkumy naznačují, že více zhoubných nádorů obsahuje více mrtvých rakovinných buněk a uvolňuje více ctDNA. Některé výzkumy však naznačují, že všechny buňky uvolňují ctDNA. Přesto se zdá, že nádorové nádory uvolňují do krve zvýšené hladiny ctDNA, čímž je ctDNA dobrým biomarkerem rakoviny.
Kvůli těžké fragmentaci a nízkým koncentracím v krvi je obtížné izolovat a analyzovat ctDNA. Existuje rozdíl mezi koncentracemi ctDNA mezi vzorkami séra a plazmy. Zdá se, že krevní sérum spíše než krevní plazma je lepší zdroj ctDNA. Ve studii Umetani a spol. Bylo zjištěno, že koncentrace ctDNA jsou konzistentně nízké v plazmě ve srovnání se sérem kvůli možné ztrátě cirkulující DNA během čištění, protože koagulace a jiné proteiny jsou během přípravy vzorku eliminovány.
Podle Heitzera a kolegů je zde několik konkrétních problémů, které je třeba vyřešit, aby využili diagnostický potenciál ctDNA:
Za prvé, předanalytické postupy je třeba standardizovat .... Výběr izolační metody, která zajišťuje extrakci dostatečného množství vysoce kvalitní DNA, je rozhodující a bylo prokázáno, že preanalytické faktory odběru a zpracování krve mohou silně ovlivnit výtěžnost DNA .... Za druhé, jedním z nejdůležitějších otázek je nedostatek harmonizace metod kvantifikace. Různé metody kvantifikace, ... produkují různé výsledky, neboť tato měření jsou zaměřena buď na celkovou, nebo pouze amplifikační DNA .... Zatřetí je méně známo původu a podrobného mechanismu uvolňování ctDNA a ve většině studií dochází ke zmatení událostí, které mohou také přispět k uvolnění ctDNA.
Cílené vs. necílené přístupy
V současné době existují dva hlavní přístupy při analýze krevní plazmy (nebo séra) pro ctDNA. První přístup je cílený a hledá specifické genetické změny naznačující nádory. Druhý přístup je necílený a zahrnuje analýzu založenou na genomu, která hledá ctDNA, která odráží rakovinu. Alternativně se sekvenování exome používalo jako nákladově efektivnější, necílený přístup. Exomy jsou části DNA, které jsou přepisovány, aby se vytvořil protein.
Při cílených přístupech se sérum analyzuje na známé genetické mutace v malém souboru mutací řidičů.
Mutace řidičů se týkají mutací v genomu, které podporují růst rakovinných buněk nebo "řídí". Tyto mutace zahrnují KRAS nebo EGFR .
Vzhledem k technologickému pokroku v posledních letech byly cílené přístupy k analýze genomu pro malé množství ctDNA uskutečnitelné. Tyto technologie zahrnují ARMS (systém refrakční mutace amplifikace); digitální PCR (dPCR); perličky, emulze, zesílení a magnetické látky (BEAMing); a hluboké sekvenování (CAPP-Seq).
I když došlo k technologickým pokrokům, které umožňují cílový přístup, cílový přístup se zaměřuje pouze na několik pozic mutací (hotspoty) a postrádá mnoho mutací řidičů, jako jsou geny pro potlačování nádorů.
Hlavním přínosem necílových přístupů k tekuté biopsii je, že mohou být použity u všech pacientů vzhledem k tomu, že test se nezakládá na opakovaných genetických změnách. Opakované genetické změny nezahrnují všechny typy rakoviny a nejsou specifickými signatami rakoviny. Přesto tento přístup postrádá analytickou citlivost a komplexní analýza nádorových genomů ještě není možná.
Je třeba poznamenat, že cena sekvenování celého genomu klesla. V roce 2006 byla cena sekvenování celého genomu přibližně 300 000 dolarů (USD). Do roku 2017 se náklady snížily na přibližně 1 000 dolarů (USD) na genom, včetně reakčních činidel a amortizace strojů pro sekvenování.
Klinická využitelnost tekuté biopsie
Počáteční snahy o použití ctDNA byly diagnostické a srovnávané hladiny u zdravých pacientů s pacienty s onkologickými onemocněními nebo s benigními onemocněními. Výsledky těchto snah byly smíšeny, přičemž jen některé studie ukazovaly významné rozdíly, které naznačovaly rakovinu, status bez onemocnění nebo relaps.
Důvodem, proč může být ctDNA použita pouze v určitém čase k diagnostice rakoviny, je proto, že variabilní množství ctDNA pochází z nádorů. Ne všechny nádory "vylučují" DNA ve stejném množství. Obecně platí, že pokročilejší, rozšířené nádory vylučují více DNA do oběhu než časné lokalizované nádory. Navíc různé typy nádorů odvádějí do oběhu různá množství DNA. Frakce cirkulující DNA, která je odvozena z nádoru, se v různých studiích a typech rakoviny pohybuje v rozmezí od 0,01% do 93%. Je důležité poznamenat, že obecně je z nádoru odvozena pouze menšina ctDNA, zbytek pochází z normálních tkání.
Cirkulační DNA by mohla být použita jako prognostický ukazatel onemocnění. Oběhová DNA by mohla být použita ke sledování změn v rakovině v průběhu času. Například jedna studie ukázala, že dvouletá míra přežití u pacientů s kolorektálním karcinomem (tj. Počet pacientů, kteří jsou ještě naživu nejméně dva roky po diagnóze s kolorektálním karcinomem) a mutace hotspotů KRAS byla 100% u těch, odpovídající cirkulující DNA. Navíc je možné, že v blízké budoucnosti může být cirkulační DNA použita k monitorování prekancerózních lézí.
Oběhová DNA by se také mohla použít k monitorování odpovědi na léčbu. Vzhledem k tomu, že cirkulující DNA nabízí lepší celkový obraz o genetické struktuře nádorů, tato DNA pravděpodobně obsahuje diagnostickou DNA, která může být použita namísto diagnostické DNA získané samotnými nádory.
Nyní se podívejme na některé konkrétní příklady tekuté biopsie.
Guardant360
Společnost Guardant Health vyvinula test, který využívá sekvenční analýzu příští generace pro profil cirkulující DNA pro mutace a chromosomální přesmyky pro 73 genů souvisejících s rakovinou. Společnost Guardant Health publikovala studii o užitečnosti tekuté biopsie v onkologii. Studie použila krevní vzorky od 15 000 pacientů s kombinovaným 50 typy nádorů.
Výsledky z testu tekuté biopsie se většinou shodují s genetickými změnami pozorovanými v biopsii nádoru.
Podle NIH:
Gardant360 identifikoval stejné kritické mutace u důležitých genů souvisejících s rakovinou, jako jsou EGFR, BRAF, KRAS a PIK3CA, při frekvencích, které byly velmi podobné těm, které byly dříve zjištěny ve vzorcích nádorové biopsie, statisticky korelující na 94% až 99%.
Navíc podle NIH vědci hlásili následující:
V druhé části studie hodnotili výzkumníci téměř 400 pacientů - z nichž většina měla rakovinu plic nebo kolorektálního karcinomu - kteří měli k dispozici výsledky krevních ctDNA a DNA nádorové tkáně a porovnaly vzorce genomických změn. Celková přesnost tekuté biopsie ve srovnání s výsledky z analýz nádorové biopsie byla 87%. Přesnost se zvýšila na 98%, když byly vzorky krve a nádorů odebrány během 6 měsíců od sebe.
Guardant360 byl přesný, i když hladiny cirkulující DNA v krvi byly nízké. Často, cirkulující DNA nádoru tvoří pouze 0,4 procent DNA v krvi.
Celkově pomocí tekuté biopsie byli výzkumníci Guardant schopni identifikovat nádorové markery, které by mohly léčit lékaři u 67% pacientů. Tito pacienti byli způsobilí pro léčbu schválenou FDA stejně jako vyšetřovací terapie.
ctDNA a rakoviny plic
V roce 2016 FDA schválila test mutace EGFR cobas pro detekci mutací EGFR v cirkulující DNA pacientů s rakovinou plic. Tento test byl první tekutou biopsií schválenou FDA a identifikovali pacienty, kteří mohou být kandidáty na léčbu cílovými terapiemi užívajícími erlotinib (Tarceva), afatinib (Gilotrif) a gefitinib (Iressa) jako léčbu první linky a osimeritinib (Tagrisso) druhá léčba. Tyto cílené terapie napadají rakovinné buňky specifickými mutacemi EGFR .
Důležité je, že kvůli vysokému počtu falešně negativních výsledků doporučuje FDA, aby vzorek tkáňové biopsie byl také odebrán od pacienta, který má negativní tekutou biopsii.
ctDNA a rakoviny jater
Počet lidí, kteří umírají na rakovinu jater, se za posledních 20 let zvýšil. V současné době je rakovina jater druhou hlavní příčinou úmrtí na rakovinu na světě. Neexistují žádné dobré biomarkery k dispozici k detekci a analýze jater, nebo hepatocelulární (HCC), rakoviny. Oběhová DNA by mohla být dobrým biomarkerem pro rakovinu jater.
Zvažte následující citace od Lagbyy a spoluautory o potenciálu využití cirkulující DNA pro diagnostiku rakoviny jater:
Hypermethylace RASSF1A, p15 a p16 byla navržena jako včasná diagnostika v retrospektivní studii zahrnující 50 pacientů s HCC. Podpis ze čtyř aberantně methylovaných genů (APC, GSTP1, RASSF1A a SFRP1) byl také testován na diagnostickou přesnost, zatímco methylace RASSF1A byla hlášena jako prognostický biomarker. Následné studie analyzovaly ctDNA u pacientů s HCC pomocí technologií hlubokého sekvenování .... Výrazně byly zjištěny aberantní počty kopií DNA u dvou nosičů HBV bez předchozího výskytu HCC v době odběru krve, ale kteří během sledování vyvinuli HCC. Toto zjištění umožnilo vyhodnotit variaci počtu kopií v ctDNA jako nástroj pro detekci HCC v rané fázi.
Slovo z
Kapalné biopsie jsou vzrušujícím novým přístupem k genomické diagnóze. V současné době jsou lékaři k dispozici některé tekuté biopsie, které nabízejí komplexní molekulární profilování, které doplňují genetickou informaci získanou z tkáňové biopsie. Existují také určité tekuté biopsie, které mohou být použity místo tkáňové biopsie - když biopsie tkání nejsou k dispozici.
Je důležité mít na paměti, že v současné době probíhají řada testů na tekuté biopsie a je zapotřebí dalšího výzkumu, aby se zjistila terapeutická užitečnost této intervence.
> Zdroje:
> Krevní test pro genetické změny nádorů ukazuje slib jako alternativu nádorové biopsie. NIH.
> Heitzer E, Ulz P, Geigl JB. Oběžná nádorová DNA jako tekutá biopsie pro rakovinu. Klinická chemie. 2015; 61: 112-123. dva: 10.1373 / clinchem.2014.222679
> Lagbaa J, Villanueva A. Tekutá biopsie v rakovině jater. Discovery Medicine. 2015; 19 (105): 263-73.
> Tekutá biopsie: Používání DNA v krvi k detekci, sledování a léčbě rakoviny. NIH.
> Umetani N, et al. Vyšší množství volné cirkulace DNA v séru než v plazmě není způsobeno hlavně kontaminovanou cizorodou DNA během separace. Ann. NY Acad Sci. 2006; 1075: 299-307.
> Wellstein A. Obecné zásady v farmakoterapii rakoviny. In: Brunton LL, Hilal-Dandan R, Knollmann BC. eds. Goodman & Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 13e New York, NY: McGraw-Hill.